核酸合成試劑篇（二）- 活化試劑發(fā)表時(shí)間：2024-08-01 17:43 SYNTHESIS 核酸合成試劑篇(二）-活化試劑 Activator 在核酸的固相合成中，縮合是第二個(gè)執(zhí)行的反應(yīng)，其基本原理是使用活化劑（activator）先將亞磷酰胺活化，然后再將其和核苷的 5’ 羥基發(fā)生SN2 親核取代反應(yīng)，生成亞磷酸三酯鍵（見圖1），完成一個(gè)核苷酸單元的連接。  圖1. 5-乙硫基四唑（5-ethylthiotetrazole, ETT）催化核苷亞磷酰胺單體和含有 5’ 羥基核苷的縮合反應(yīng)， 以及后續(xù)的氧化反應(yīng) 目前應(yīng)用最多的活化試劑是 0.25 M 濃度 ETT 的乙腈溶液。1-H 四唑也有部分應(yīng)用，但是 1-H 四唑在乙腈中容易結(jié)晶，使用不便，而且反應(yīng)活性也叫 ETT 差，目前已經(jīng)較少采用。ETT 在 DNA 合成中表現(xiàn)出了良好的化學(xué)活性，但是在 RNA 合成中活性較低，這主要是因?yàn)?RNA 單體中 2’-羥基采用了大位阻的硅保護(hù)試劑（如 TBDMS 或 TOM），導(dǎo)致反應(yīng)速率降低數(shù)十倍。目前在 RNA 合成中主要使用 5-芐硫基四唑（5-benzylthiotetrazole, BTT），該試劑活性要高于 ETT，可以實(shí)現(xiàn) RNA 的高效合成。 在大規(guī)模的核酸合成中，ETT 的活性較難滿足縮合工藝的要求，因此研究人員多采用 4, 5-二氰基咪唑（4, 5-dicyanoimidazole, DCI）來作為活化試劑，該試劑活性較 ETT 更高，而且使用量也更加經(jīng)濟(jì)。 除了四唑鹽和二氰基咪唑類化合物，多種銨鹽也被用于活化試劑，如吡啶鹽酸鹽、吡啶三氟乙酸鹽、N-氰甲基四氫吡咯四氟硼酸鹽、N-氰甲基哌啶四氟硼酸鹽、N-氰甲基二異丙胺四氟硼酸鹽、以及 1-甲基咪唑鄰磺酰苯甲酰亞胺鹽等，均可用做活化試劑，如圖 2。  圖2. 銨鹽催化核苷亞磷酰胺單體和 含有5’羥基核苷的縮合反應(yīng) 活化試劑多需要配成無水乙腈的溶液來使用，配置活化試劑的乙腈需要使用無水乙腈，水含量需要控制在 25 ppm 以下，過高的水含量可導(dǎo)致亞磷酰胺與活化劑形成的活性中間體失活，影響縮合反應(yīng)的效率。在活化試劑的使用過程中，也需要注意水蒸氣對(duì)該試劑以及活化步驟的影響，可以通過向開封的活化試劑中加入分子篩來控制活化試劑的含水量，以達(dá)到較好的合成效果。 對(duì)于不同結(jié)構(gòu)的核酸合成，活化試劑也有相關(guān)的最優(yōu)選項(xiàng)（見表 1），但是活化試劑的選擇不僅要看活性，還需要考慮其價(jià)格、在乙腈中的溶解度、結(jié)晶能力以及化學(xué)安定性等諸多因素。  表1. 適用于不同核酸結(jié)構(gòu)的活化劑 看到這里，如您有任何關(guān)于核酸合成的疑問，都可以發(fā)送郵件至： chenyiduo@hjgc-automation.com 我們會(huì)快速響應(yīng)您的需求！ |
